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本试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取磷酸化蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒含有的独特配方能充分保护磷酸化蛋白的磷酸化，够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。

• 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至30分钟～1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• Western实验内参可以选用beta-actin、GAPDH、Tubulin。

• 细胞磷酸化蛋白提取：
  
  • 提取液制备：每500μL冷的蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    
  • 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，1000rpm条件离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    注：
    ● 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
    
  • 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    
  • 每5×10⁶个细胞中加入500μL冷的蛋白提取液，混匀后，在4℃条件下振荡15～20分钟。
    
  • 在4℃，14000rpm条件下离心15分钟。
    
  • 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到磷酸化蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
    ● 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 组织磷酸化蛋白提取：
  
  • 提取液制备：每500μL冷的蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    
  • 取100mg组织样本剪碎，加入总蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
    注：
    ● 用液氮研磨的方法更佳。
    
  • 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到磷酸化蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。